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为什么《我的一个道姑朋友》双笙是侵权并下架，LON的版本却还在，并标明原唱，LON不算侵权吗？ - 知乎

为什么《我的一个道姑朋友》双笙是侵权并下架，LON的版本却还在，并标明原唱，LON不算侵权吗？ - 知乎首页知乎知学堂发现等你来答切换模式登录/注册侵权我的一个道姑朋友（歌曲）双笙为什么《我的一个道姑朋友》双笙是侵权并下架，LON的版本却还在，并标明原唱，LON不算侵权吗？下面是我在酷狗截的图。 [图片]显示全部关注者3被浏览24,327关注问题写回答邀请回答好问题1 条评论分享5 个回答默认排序比豬还豬独立影扯、乐扯、部分剧扯人、历史政治扯淡人关注肯定是侵权啊，这没什么好辩驳的。只是为什么没下架，也可能背后有什么其他内部交易发布于 2018-08-09 11:42赞同添加评论分享收藏喜欢收起小白呐关注网易有发动态说明原因的，截图大概就是这个样子了就道姑这首歌而言的话，要算原唱应该是lon但是作词作曲都不是她所以应该唱之前并不了解这个事情知道这首歌侵权之后有一直想办法删歌的似乎因为这首歌被骂挺惨的……感觉有点可怜…我也是今天才了解到的…大概就是这样子了。发布于 2018-12-01 00:02赞同 13添加评论分享收藏喜欢

股票基础知识~LON指标 - 知乎

股票基础知识~LON指标 - 知乎切换模式写文章登录/注册股票基础知识~LON指标huyong点热资讯、原创作者等短线指标主要用于短线买卖和短期趋势的判别。但是为了进行中、长线的操作和过滤掉一些虚假的信号，推出了长线指标LON用于中长线的操作。长线指标更加强调趋势的概念，该指标就是要找到一个趋势以及中长线的买入卖出点。通过长线持有股票而获得更大收益是一部分股民期望的投资方式，它既可以免去经常短线操作的浮躁心理，也能取得最大的利润。但事实上，股民很难较为准确地预测和寻找类似的股票。可以用一些趋势指标如平滑异同移动平均线(MACD)等来判断，但效果可能并不理想。在这方面LON长线指标有它的特长。LON长线指标表现形式类似平滑异同移动平均线(MACD)和三重指数平滑移动平均指标(TRIX)等趋势型指标，但更加强调一种趋势的概念。该指标是由白色指标线和黄色均线构成，用红、绿色柱状线表示强弱趋势，并力图找到一种趋势以及中长线的买入卖出点，在实践中也显示出更胜一筹的情况。LON长线趋势指标应用法则：1、买入点判断：当在零轴下方，lon(白线)向上交叉均线时开始关注该股。直到lon穿过零轴绿色柱状线翻红方可作为中长线介入点。2、卖出点判断：当在零轴上方，一旦lon线向下交叉均线形成死叉就应该立即卖出。LON指标优点：优点一：信号稳定，可提前给出见顶信号。优点二：过滤掉一些虚假信号。优点三：对一些庄股非常有效。发布于 2020-12-12 17:10赞同 122 条评论分享喜欢收藏申请

LON（日本唱见）_百度百科

日本唱见）_百度百科网页新闻贴吧知道网盘图片视频地图文库资讯采购百科百度首页登录注册进入词条全站搜索帮助首页秒懂百科特色百科知识专题加入百科百科团队权威合作下载百科APP个人中心LON是一个多义词，请在下列义项上选择浏览（共5个义项）添加义项收藏查看我的收藏0有用+10LON播报讨论上传视频日本唱见Lon是活跃在ニコニコ动画的歌い手（国内称唱见/歌见）。姓名是ろん（Lon），罗马音为ron，以活泼元气的声音闻名，有“野生镜音”之称，是神秘可爱的两声类。外文名LON名字ろん别称呼lon、ron生日10月10日性别女co号34527mylist8580209twiLOOON4目录1个人简介2五月病3人物特点4个人专辑5同人合作6投稿曲目7参与CD个人简介播报编辑id=22220686野生称号：野生镜音活跃年份：2008年至今 [1]ろん以活泼元气的声音闻名，有“野生镜音”之称。是神秘可爱的两声类，极少公开个人资料，且没有博客，没人知道她的姓名/身高/体重等等。初投稿是「未来の歌」后来遭删除，仍在的初投稿是2008年09月14日02:40投稿的「ワールドイズマイン【boku ver.】」经常会参加各类同人CD，在2011年11月02日发行了第一张个人商业CD《EXIT TUNES PRESENTS ろん BEST -ひっしに歌ってみた编-》是UTAU角色“天羽ソラ”的声源五月病播报编辑因为2010年5月20日投稿「おちゃめ机能」→五月病让ろん彻彻底底地红了起来，此曲目前再生数已经超过1000万再生。 [2]人物特点播报编辑元气可爱的声音和与之相反的超乎常人的广阔音域与穿透力，让ta一出现就得到了关注。有稳定的高音并且十分绚丽，如「Last Night, Good Night 歌った Ver.ろん」作为唱见而被使用的名字是ろん，也用ロン，Lon的名义。还有着仆音ロン的昵称前期的声线与vocaloid的镜音リン·レン类似。自称是“仆（boku）”，所以被广泛称为：ボクっ娘（boku娘）”，同时也被誉为“天使般的正太音”。翻唱的V家的歌曲、捏他曲的再生数都比较高。一般喜欢翻唱镜音连对于未来而感到不安的曲子，以及ラマーズP、汚点P的曲子也是本人所喜欢的。在即兴演唱时对于出现的大段台词把握得非常棒，他人对节奏与滑舌的评价也很高。投稿的特征：XXX 歌った经常被标记的标签：两声类、天使のショタ声、ボクっ娘、R&B&M、ショタコンホイホイ、何かに目覚める动画。个人专辑播报编辑EXIT TUNES PRESENTS ろん《EXIT TUNES PRESENTS ろん BEST -ひっしに歌ってみた编-》CD (2011/11/2)人気歌い手『ろん』のメジャーファーストアルバムが遂に発売！！[収録予定曲]※収録内容は変更になる场合がございます。1.からげんき　歌った / ラマーズP feat.ろん2.トリノコシティ　歌った / 40mP feat.ろんEXIT TUNES PRESENTS ろん3.ネトゲ廃人シュプレヒコール　歌った / さつきがてんこもり feat.ろん4.イーガービリーバー　歌った / アヒル军曹P feat.ろん5.白菜　歌った / ラマーズP feat.ろん6.ウインク・トランジ・スター　歌った / さつきがてんこもり feat.ろん7.空中庭园　歌った / アヒル军曹P feat.ろん8.リモコン　歌った / じーざす（ワンダフル☆オポチュニティ！）feat.ろん9.嘘とタイムマシン　歌った / アヒル军曹P feat.ろん10.STOMP THE ENEMY　歌った / さつきがてんこもり feat.ろん11.GHOST　歌った / アヒル军曹P feat.ろん12.右肩の蝶　歌った / のりぴー feat.ろん13.お断りします　歌った / さつきがてんこもり feat.ろん14.ウコンエキス　歌った / ラマーズP feat.ろん15.NEW（FULL ver.）歌った / ラマーズP feat.ろん16.crack　歌った / keeno feat.ろんろんかば -J-POP ZOO-ろんかば Jacket Illustration：秋赤音(2张)【Track List】（※収録内容は変更になる场合がございます。）※顺不同・RPG（SEKAI NO OWARI）　produced by 亀田诚治・そばかす（JUDY AND MARY）　produced by 恩田快人、鸟海刚史・ESCAPE（MISIA）　produced by フルカワユタカ・午前8时の脱走计画（Cymbals）　produced by ミト（クラムボン）・ブルーバード（いきものがかり）　produced by 铃木Daichi秀行・First Love（宇多田ヒカル）　produced by keeno・Endless Story（REIRA starring YUNA ITO）　produced by おさむらいさん・スピカ（スピッツ）　produced by ジミーサムP・JOY（YUKI）　produced by ジミーサムPBonus Track・スイートマジック（2015 Summer ver.）　produced by Junky　※アルバムアレンジバージョン [3]【Loppi·HMV限定オリジナルCD】・ドラゴンライジング　歌った / 秋赤音VSろん・ロストワンの号哭　歌った / Neru feat.ろん同人合作播报编辑与好友そらる，スズム，さいね，MACCO有一个同人社团“あすかそろまにゃーず”，此团发行了7张同人CD，其中ろん酱参加过的有6张，分别是《ユウアイスウ》《Hallows》《学园リバーシ》《空中さんぽ》《青春の味と空论の君》《绝望性:ヒーロー治疗薬》和另一个nico翻唱歌手そらる（soraru）组成组合そらろん（soraron），两人合作过很多作品，并且两人有6首再生数过百万的合作曲。投稿曲目播报编辑动画投稿2008年09月14日 02:40 投稿ワールドイズマイン【ぼくver.】　歌った2008年10月01日 10:47 投稿応援歌“骉麤～とりぷるばか～”　歌ってみた2008年10月27日 18:43 投稿 “镜音レンの暴走”歌った(已删除)2008年12月14日 15:18 投稿【ぽっぴっぽー】歌ってみた　ラマーズP×ろん2009年01月23日 19:48 投稿闇のダンスサイト　歌った(已删除)2009年02月04日 18:23 投稿『ロリ诱拐』　歌ってみた(已删除)2009年02月12日 20:16 投稿ジュブナイル　歌った2009年02月24日 11:33 投稿高血圧ガール　歌った(已删除)2009年03月30日 00:02 投稿 Last Night, Good Night 歌った(已删除)2009年05月30日 10:51 投稿 GHOST　歌った2009年12月18日 14:00 投稿右肩の蝶　歌ったLON图集(10张)2010年04月29日 23:24 投稿イーガー?ビリーバー　歌った 2010年05月20日 14:00 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中国科大揭示Lon蛋白酶在单个蛋白水解位点对底物进行持续切割

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中国科大揭示Lon蛋白酶在单个蛋白水解位点对底物进行持续切割

发布时间：2021-11-15

Lon蛋白酶是一种高度保守的蛋白酶，存在于细菌、古菌和真核细胞器中。细菌Lon通过降解异常蛋白，在蛋白质稳态的质量控制中发挥着关键作用，同时通过降解应激反应、毒力和群体行为相关的特定调节蛋白，在特定的细胞生理控制中发挥着关键作用。Lon组装成同源六聚体复合物，每个单体中包括共价连接的N端区域、AAA+（与多种细胞活动相关的ATP酶）域和蛋白酶域。晶体结构表明，AAA+和蛋白酶结构域形成一个封闭的腔室，六个ATP酶位点朝外，六个蛋白水解活性位点朝内。已有研究表明了与共价抑制剂结合的蛋白水解活性位点的结构，然而，与蛋白酶活性位点结合的底物结构尚未确定。迄今为止，人们致力于了解蛋白质底物如何被AAA+蛋白酶的AAA+环识别、去折叠和移位，张凯铭/张崇毅团队在2021年10月在JBC和Science Advances连续发表两篇文章，阐述了上述相关的研究工作。然而，关于底物在到达蛋白水解室后如何在蛋白水解活性位点水解，我们知之甚少。前人的研究报道了包括Lon在内的几种AAA+蛋白酶降解的蛋白质底物会经历持续性蛋白水解过程，由此蛋白质底物被切割成小肽，而不会释放部分降解的中间体。由寡聚酶形成的“封闭室”曾被提出可以用于隔离蛋白质底物，从而为观察到持续性降解提供了一个直接的解释。2021年11月10日，中国科学技术大学张凯铭研究组和台北中央研究院张崇毅研究组再次合作在Sciences Advances杂志发表题为“Processive cleavage of substrate at individual proteolytic active sites of the Lon protease complex”的文章。论文解析了Lon复合体和水解底物的结合结构，揭示了Lon蛋白水解的作用机制。在本次工作中，中科大生医部副研究员李珊珊等人利用结构和生化证据表明上述“封闭室”并不是此前观察到Lon进行持续性降解的直接原因。高分辨率冷冻电子显微镜密度图（2.4 Å）揭示了在每个蛋白水解活性位点上的底物多肽的清晰密度。此外，Lon与底物多肽的晶体结构表明，底物总是通过C末端与Lon结合，而Lon的六个活性位点中的每一个都形成一个狭窄的结合槽，仅容纳底物的非引物残基；并进一步揭示了C-to-N的加工裂解机制。蛋白质降解试验证实，持续性降解发生在单个蛋白水解活性位点水平。此外，研究人员在底物结合槽的出口侧发现了一个以前未被识别的酸性残基；这种保守的非催化残基对持续性裂解活性至关重要，可能通过与裂解中间体的羧基-羧酸酯相互作用促进持续性蛋白水解。总之，这些结果揭示了一种以前未被发现的Lon蛋白酶持续性降解底物的机制。图例：Lon的蛋白水解机制。a.MtaLonA的2.4-Å冷冻电镜结构。b.位于蛋白水解活性位点上的底物多肽冷冻电镜密度（洋红色）。斯坦福大学Wah Chiu院士为该研究工作提供了宝贵意见。本研究获得了Stanford-SLAC电镜平台、台北中央研究院电镜平台和中国科学技术大学细胞动力学教育部重点实验室及冷冻电镜平台的大力支持。中国科学技术大学为该工作的第一完成单位，生命科学与医学部李珊珊副研究员和台北中央研究院博士后谢侃言为共同第一作者。张凯铭、张崇毅研究员为共同通讯作者。原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abj9537

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中国科大解析Lon蛋白酶的完整三维结构并揭示其底物识别与转移的分子机制

10月10-15日我校细胞动力学教育部重点实验室张凯铭团队在解析Lon蛋白酶的完整三维结构并揭示其底物识别与转移的分子机制取得重要进展，与台湾中央研究院张崇毅团队在期刊JBC和Sciences Advances合作连续发表论文。Lon AAA+蛋白酶（LonA）是一种在原核生物和真核生物细胞器中保守的ATP依赖性蛋白酶。LonA组装为同源六聚体，每个单体都包含一个N端结构域、一个中间ATP酶结构域和一个C端蛋白酶结构域。LonA通过降解受损或错误折叠的异常蛋白质在细胞蛋白质稳态中发挥重要作用，从而防止这些不需要的蛋白质种类形成有毒聚集体。LonA还通过降解特定的调节蛋白来调控多种生物过程。前人的研究揭示了LonA的多种功能和结构特征。具有开放活性位点构象的Lon蛋白酶域采用六重对称结构，而具有非活性蛋白水解位点构象的LonA则采用开放螺旋六聚体结构。ADP结合的LonA六聚体的晶体结构揭示了ADP如何通过诱导形成封闭的降解室来抑制LonA活性。通过假设来自两对三个非相邻单体的无核苷酸和ADP结合状态之间的结构转换，建立了基于ADP结合结构底物易位模型。然而最近的底物结合AAA+蛋白的冷冻电镜结构不支持上述简单的一步转换模型，认为其ATP酶结构域围绕中心定位的底物多肽链以螺旋梯状排列，包括最近人源和鼠疫耶尔森氏菌Lon蛋白酶的冷冻电镜结构均支持持续性旋转机制。但在这些工作中，用于重构的细菌Lon是一个Walker-B突变体；而人源Lon的结构则显示了不同的底物结合方式和核苷酸结合状态，表明Lon可能存在复杂的底物转移机制。10月10日，张凯铭和张崇毅团队合作在期刊JBC发表题为“Molecular basis for the ATPase-powered substrate translocation by the Lon AAA+ protease”的文章。张凯铭课题组李珊珊等解析了Meiothermus taiwanensis Lon底物结合状态的3.6-Å冷冻电镜结构，发现ATPase结构域的双孔环介导底物相互作用，由处于不同ATP结合和水解状态的四个连续单体以螺旋梯状排列，揭示了其通过LonA特异性变构实现持续性旋转易位的分子机制。AAA+蛋白酶与底物结合的核苷酸结合状态比较顶部视图显示了核苷酸和底物的结合状态。与底物结合的原体呈不同深浅的绿色。然而到目前为止，Lon六聚体的现有报道的所有结构中没有包含N端区域，Lon如何选择蛋白质靶标作为底物、控制底物进入AAA+结构域、并介导底物去折叠的机制尚不清楚。10月15日，合作团队在期刊Sciences Advances继续发表题为“Complete three-dimensional structures of the Lon protease translocating a protein substrate”的延续性工作。张凯铭课题组李珊珊等利用冷冻电镜进一步解析了Meiothermus taiwanensis Lon底物结合状态的完整三维结构，分辨率达2.4 Å。这些结构显示了一个具有张拉整体三角形复合体的多层结构，独特地由六个长N端螺旋构成。相互锁定的螺旋三角形组装在六聚体核心的顶部，以展开一个由六个球状底物结合域组成的网。它作为一个多用途平台，控制底物进入AAA+环、提供基于标尺的底物选择机制、并充当滑轮装置以促进AAA+环将ATP驱动的构象变化转化为机械力来推动易位底物的展开。该研究成果为理解Lon和其他具有类似活性的AAA+蛋白酶的结构机制提供了一个完整的框架。全长Lon的冷冻电镜结构解析。a.冷冻电镜结构。b.三维原子模型。c,d.二类单体的结构及结构域示意图。e.作用机制示意图。斯坦福大学Wah Chiu院士为此工作提供了宝贵意见。本研究获得了Stanford-SLAC电镜平台、台湾中央研究院电镜平台和中国科学技术大学细胞动力学教育部重点实验室及冷冻电镜平台的大力支持。中国科学技术大学为第一完成单位，生命科学与医学部李珊珊副研究员为第一作者，张凯铭、张崇毅研究员为共同通讯作者。Sciences Advanceslink：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abj7835JBClink （扫描下方二维码打开）（细胞动力学教育部重点实验室、合肥微尺度物质科学国家研究中心、中国科大生医部、科研部）

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作者：吴长锋来源：科技日报发布时间：2021/10/27 9:15:55

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Lon蛋白酶完整三维结构获解析

有助理解相似酶结构

科技日报讯（记者吴长锋）记者10月20日从中国科学技术大学获悉，该校细胞动力学教育部重点实验室张凯铭团队与合作者合作，解析出Lon蛋白酶的完整三维结构并揭示其底物识别与转移的分子机制，研究成果日前分别发表在期刊《生物化学杂志》和《科学进展》上。

Lon AAA+蛋白酶（LonA）是一种在原核生物和真核生物细胞器中保守的ATP依赖性蛋白酶。LonA组装为同源六聚体，每个单体都包含一个N端结构域、一个中间ATP酶结构域和一个C端蛋白酶结构域。LonA通过降解受损或错误折叠的异常蛋白质在细胞蛋白质稳态中发挥重要作用，从而防止这些不需要的蛋白质种类形成有毒聚集体。LonA还通过降解特定的调节蛋白来调控多种生物过程。然而目前为止，现有报道中Lon六聚体的所有结构中没有包含N端区域，Lon如何选择蛋白质靶标作为底物、控制底物进入AAA+结构域、介导底物去折叠的机制尚不清楚。

张凯铭课题组解析了Lon蛋白酶底物结合状态的冷冻电镜结构，发现ATP酶结构域的双孔环介导底物相互作用，由处于不同ATP结合和水解状态的四个连续单体以螺旋梯状排列，揭示了其通过LonA特异性变构实现持续性旋转易位的分子机制。同时，这些结构显示了一个具有张拉整体三角形复合体的多层结构，独特地由六个长N端螺旋构成。相互锁定的螺旋三角形组装在六聚体核心的顶部，以展开一个由六个球状底物结合域组成的网。它作为一个多用途平台，控制底物进入AAA+环、提供基于标尺的底物选择机制、并充当滑轮装置以促进AAA+环将ATP驱动的构象变化转化为机械力来推动易位底物的展开。

该研究成果为理解Lon和其他具有类似活性的AAA+蛋白酶的结构机制提供了一个完整的框架。

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细菌Lon蛋白酶研究进展

微生物学通报 2019, Vol. 46 Issue (7): 1706−1711

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刘郁夫, 董浩, 孙石静, 陈瑞爱, 丁家波

LIU Yu-Fu, DONG Hao, SUN Shi-Jing, CHEN Rui-Ai, DING Jia-Bo

细菌Lon蛋白酶研究进展

Research progress on bacterial Lon protease

微生物学通报, 2019, 46(7): 1706-1711

Microbiology China, 2019, 46(7): 1706-1711

DOI: 10.13344/j.microbiol.china.190022

文章历史

收稿日期: 2019-01-06

接受日期: 2019-04-09

网络首发日期: 2019-04-24

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刘郁夫, 董浩, 孙石静, 陈瑞爱, 丁家波. 细菌Lon蛋白酶研究进展[J]. 微生物学通报, 2019, 46(7): 1706-1711.

LIU Yu-Fu, DONG Hao, SUN Shi-Jing, CHEN Rui-Ai, DING Jia-Bo. Research progress on bacterial Lon protease[J]. Microbiology China, 2019, 46(7): 1706-1711.

细菌Lon蛋白酶研究进展

刘郁夫1,2

董浩3

孙石静1

陈瑞爱2

丁家波1

1. 中国兽医药品监察所国家动物布鲁氏菌病参考实验室北京 102600;

2. 华南农业大学兽医学院广东广州 510642;

3. 中国动物疫病预防控制中心北京 102600

收稿日期: 2019-01-06; 接受日期: 2019-04-09; 网络首发日期: 2019-04-24

基金项目: 国家自然科学基金(31602055)；国家重点研发计划(2016YFD0500903)

通信作者:

丁家波, Tel：010-61255327；E-mail：dingjiabo@126.com.

摘要: Lon蛋白酶是首个被鉴定的ATP依赖蛋白酶家族成员，在原核生物中发挥着降解错误折叠蛋白、维持胞内蛋白质平衡的作用。最近研究表明Lon蛋白还可以作为压力应激蛋白，参与降解多种转录调控因子和二元调控系统，改变细菌胞内的生理代谢过程以适应环境的改变。本文从Lon蛋白酶的结构、功能与上下游调控网络作一综述，旨在更全面清楚地了解ATP依赖蛋白酶的生理功能，以期为其胞内调控机制研究提供参考。

关键词:

Lon ATP依赖蛋白酶蛋白结构基因功能毒力因子

Research progress on bacterial Lon protease

LIU Yu-Fu1,2

DONG Hao3

SUN Shi-Jing1

CHEN Rui-Ai2

DING Jia-Bo1

1. National Reference Laboratory for Animal Brucellosis, China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 102600, China;

2. College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong 510642, China;

3. China Animal Disease Control Center, Beijing 102600, China

Received: 06-01-2019; Accepted: 09-04-2019; Published online: 24-04-2019

Foundation item: National Natural Science Foundation of China (31602055); National Key Research and Development Program of China (2016YFD0500903)

*Corresponding author:

DING Jia-Bo, Tel: 86-10-61255327; E-mail: dingjiabo@126.com.

Abstract: Lon protease is the first identified ATP-dependent protease that plays critical role in degrading misfolded proteins and maintaining intracellular protein balance in prokaryotes. Recent studies have suggested that, as a pressure-stress protein, Lon was involved in the degradation of a variety of transcription regulators and two-component regulatory system in bacteria, resulting in altered physiologically metabolic process of bacteria cells to adapt to the environment change. In this paper, the structure, function, and up and down-stream regulatory network of bacterial Lon protease are reviewed, aiming at enhancing understanding in the physiological function of Lon, as well as providing basis for elucidating the mechanism of intracellular regulation.

Keywords:

Lon ATP-dependent protease Protein structure Gene function Virulence factor

Lon蛋白是首个被鉴定的ATP依赖蛋白酶，早期科学家发现大肠杆菌在紫外照射下形成长线型、分裂受抑制的突变表型，因此把该突变基因取名为lon[1]。后续研究发现Lon蛋白具有蛋白酶活性，属于AAA+ (ATPases associated with a variety of cellular activities)蛋白家族成员[2]。该蛋白家族成员还包括Clp蛋白酶(ClpAP、ClpXP、ClpYQ)和FtsH蛋白酶等，它们可降解错误折叠蛋白，在调控细菌内蛋白质稳态过程中发挥重要作用[3]。 Lon蛋白广泛存在于自然界中，在细菌、真菌、古细菌等原核生物和真核生物基因组中均能比对找到Lon同源蛋白，提示ATP依赖蛋白酶的蛋白降解功能作为细菌内一类保守的蛋白调控机制，具有靶点多样性且发挥重要作用[4]。最近研究表明Lon蛋白除了降解错误折叠蛋白外，还通过降解多种调节蛋白参与调节细菌毒力[5]、耐药性[6]、胞内压力应激反应[7]、DNA修复[8]等多个细菌生理过程。本文通过对Lon蛋白酶的结构、功能与上下游调控网络作一综述，旨在更全面清楚地了解Lon蛋白酶的生理功能及其精密的胞内调控网络，为基因工程弱毒疫苗的研发和潜在药物治疗靶点的筛选提供参考。 1 Lon蛋白结构及水解机制

大肠杆菌(Escherichia coli) Lon蛋白由784个氨基酸组成，大小约为87 kD，在细胞质中形成六聚体环状复合物(图 1)[9]。每个Lon多肽链由3个结构域组成：N端结构域参与底物的识别；ATP酶结构域(AAA+)负责ATP结合和水解，为Lon蛋白酶发挥酶活性提供能量；酶活性中心由Ser679-Lys722二联体组成，具有蛋白水解活性[10]。

图 1　电镜观察Lon蛋白及Lon蛋白电子密度图[9]

Figure 1　Electron microscopy and electron-density map of Lon protein[9]

注：A：电镜视野下观察Lon蛋白颗粒；B：电镜下Lon蛋白十二聚体(上排和左下)和六聚体(右下)的典型视野；C：B. subtilis Lon蛋白晶体结构的电子密度图；D：E. coli Lon蛋白晶体结构的电子密度图.

Note: A: Representative field-of-view of electron micrographs of single wild-type Lon particles. (29 000× magnification); B: Representative class images of dodecamers (upper and lower left) and hexamers (lower right, enclosed in white box); C: The electron-density map of crystal structure of B. subtilis Lon; D: The electron-density map of crystal structure of E. coli Lon.

图选项

根据Lon蛋白氨基酸序列的同源性和结构特征，可将Lon蛋白分为两类：存在于大部分细菌的LonA和主要存在于古细菌中的LonB；LonA含有大段的N端结构域，而LonB缺少N端结构域，但是在AAA+结构域中插入了一段转膜区(图 2)[2]。

图 2　LonA和LonB的结构域[2]

Figure 2　The structural domain of LonA and LonB[2]

注：A：细菌中Lon蛋白(主要为LonA)结构域示意图；B：古细菌中LonB蛋白结构域示意图，TM指代古细菌跨膜区.

Note: A: Domain organization of Lon proteases found in bacteria (predominantly LonA); B: Domain organization of Lon proteases found in archaea (Lon B), TM refers to the trans-membrane anchor.

图选项

Lon蛋白酶及其伴侣分子(主要是DanK系统)在降解细胞内错误折叠蛋白，以及维持胞内稳态过程中发挥重要作用[11]。由于Lon蛋白酶的底物切割位点位于圆柱状封闭空间的内部，与细胞质分隔开，所以也将Lon蛋白酶归类于“自独立” (Self-compartmentalized)蛋白酶[7]。Lon蛋白酶的水解机制与大多数蛋白酶类似：(1)在接头蛋白的协助下，Lon蛋白酶N端结构域识别并结合特异性蛋白底物，此过程不消耗ATP；(2) ATP结合水解位点使蛋白酶复合体的构象发生改变，底物多肽去折叠；(3)在移位酶的作用下，将多肽移至蛋白酶活性中心，蛋白酶切割多肽[10]。 2 Lon蛋白酶对细菌表型的影响

研究人员起初发现E. coli Lon突变株的分裂受抑制，生长缓慢，菌体形成长线形，并且对紫外线的敏感性增强[1]。接着研究者们陆续发现Lon蛋白酶参与细胞内多个生理过程，起翻译后调控的作用[5, 12]。 Su等发现根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) Lon突变株并没有表现出丝状细菌形态和紫外敏感性，但突变株生长缓慢，电镜观察发现超过80%的细菌形态发生改变，并且在37 ℃环境下可诱导lon基因转录和蛋白水平的表达上调[13]。幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori) lon基因突变后使得RdxA蛋白的甲硝唑还原酶活性下降44%，并最终导致H. pylori对甲硝唑的敏感性上升，亲本株对甲硝唑的最小抑菌浓度(Minimal inhibit concentration，MIC)是lon突变株的3倍[14]。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) lon基因突变株可影响细菌的分裂过程，突变株导致细菌运动能力明显缺陷，对环丙沙星的敏感性增强8倍[15]。Xie等证明LonA是胸膜放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)重要的压力耐受蛋白，该基因缺失在正常环境下(37 ℃)不影响细菌生长速度，但在低温(25 ℃)和高温(42 ℃)下导致缺失株均表现生长缺陷，环境应激实验表明lonA基因突变导致细菌对高渗、活性氧介质的敏感性增强[16]。 Pressler等系统研究了霍乱弧菌(Vibrio cholerae)胞内ATP蛋白酶的功能及作用[17]；Δlon可分别通过上调VpsA基因和Ⅳ型鞭毛相关基因的转录，使细菌胞外多糖的产量上升，细菌运动性增强，同时下调FliA等毒力相关基因的表达，显著降低细菌在小鼠体内的定殖数量[17]。Fernández等发现P. aeruginosa lon基因缺失株和Hfq过表达菌株均表现出运动能力、生物被膜形成能力缺陷，提示Hfq蛋白在细菌胞内聚集是形成lon突变株表型的原因之一[18]。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) Lon蛋白通过接头分子SmiA介导，特异性地直接降解鞭毛合成的主要调控蛋白SwrA，从而控制细菌表面菌毛的密度，改变细菌的活动方式[19]。在不同细菌中，Lon蛋白发挥着不完全一致的功能，lon基因突变可导致多种表型。总体来说，lon基因突变可导致细菌的生长速度、紫外敏感性、细菌形态、运动性、抗生素敏感性以及细菌生物被膜发生改变。 3 Lon蛋白对致病菌毒力的影响

目前已报道lon基因在多种细菌，特别是革兰氏阴性菌的致病过程中发挥作用。Breidenstein等通过荧光定量PCR发现lon基因突变可下调P. aeruginosa三型分泌系统相关基因的表达，并利用人支气管上皮细胞模型、阿米巴原虫模型和CD-1小鼠模型证明P. aeruginosa毒力减弱，lon缺失株感染组小鼠的支气管载菌量为亲本株的1/500[15]。Xie等实验证明lonA基因缺失可通过改变细菌生物被膜的合成能力引起细菌毒力下降，亲本株在BALB/c小鼠肺脏、肝脏和肾脏中的载菌量为突变株的100−1 000倍，但是lonC基因不影响细菌毒力[16]。在沙门氏菌(Salmonella enterica)中lon基因突变可通过降低细菌胞外多糖的产量导致细菌毒力减弱，Lalsiamthara等以强毒株为亲本构建S. enterica Δlon基因缺失工程弱毒疫苗，免疫本体动物可诱导机体产生特异性IgG和外周血淋巴细胞介导的细胞免疫，同时提供动物机体对亲本毒株的抵抗力[20]。细菌为适应宿主体内环境，可通过细菌分泌系统分泌毒力蛋白到宿主细胞质中，为自己复制繁殖提供最适条件。近期研究显示，Lon蛋白还可调控细菌分泌系统的表达，间接改变细菌的毒力[12]。Rogers等利用基因芯片技术发现与亲本毒株相比，V. cholerae LonA突变株中参与生物被膜形成的基因表达显著减少，而与Ⅵ型分泌系统相关的基因表达增加，引起Ⅵ型分泌系统活性增强，对小鼠致病性减弱，然而两者之间相互作用的机制尚不明确[21]。Zhou等的研究表明，Lon蛋白645位丝氨酸的磷酸化可导致Lon蛋白水解酶失效，可使HrpG更稳定，进而促进柑桔溃疡病菌(Xanthomonas citri) T3SS分泌系统的表达，对维持细菌的毒力至关重要[12]。Lee等发现，lon基因突变导致T3SS的表达上调和运动能力下降，后续研究发现Lon蛋白可间接作用Rcs和Gac-Csr调控系统，调节梨火疫病病原菌(Erwinia amylovora)的毒力[5]。随着外界环境的改变，细菌在面对各种胁迫环境时会启动胞内的调控机制，改变胞内一系列的生理代谢途径以适应环境。而大量文献报道，lon基因突变后可导致致病菌毒力下降，提示Lon蛋白酶介导的翻译后调控作用对细菌在胁迫环境下的存活至关重要，是致病菌关键毒力基因之一，可作为基因工程致弱菌的潜在修饰靶点。 4 Lon蛋白的下游作用靶点研究

E. coli MarA蛋白是Lon蛋白酶底物之一，在E. coli中lon基因突变导致MarA及其下游底物在细菌体内聚集，引起细菌对抗菌药物阿司匹林和多种抗生素的敏感性增强[22]。在大肠杆菌SOS应答过程中，E. coli细胞分裂抑制蛋白SulA的表达得到显著上调[23]，lon基因突变后细菌丧失降解SulA的能力，导致细菌分裂周期调控紊乱，并使细菌的生长速度减缓[24]。 Lon蛋白在细胞内不仅能降解错误折叠蛋白，起到维持蛋白质动态平衡的作用，同时Lon蛋白还是一种重要压力应激蛋白，细菌在各种逆境的胁迫下，可降解各种不稳定的调节因子，通过调节细胞内一系列生理生化反应和代谢途径来适应不利环境[25]。 S. enterica铁离子摄入系统的FeoB和FeoC基因控制细菌Fe2+离子的摄入，Kim等研究表明Lon蛋白酶可水解S. enterica铁离子输入蛋白FeoC，调控细菌在胁迫环境下细菌体内的铁离子平衡，避免在遇到极端环境时金属离子的过度吸收[26]。Jonas等发现新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)热应激可诱导Lon蛋白酶的合成，并在HSP70伴侣分子DnaK的介导下，直接降解细菌复制的启动蛋白DnaA，抑制细菌DNA的复制，从而形成细菌在热应激环境下抑制复制的保护机制[27]。Fernández等利用定量蛋白质组学方法探索Lon蛋白作用靶点，发现P. aeruginosa的lon基因突变株中，RNA结合蛋白Hfq的含量显著增加，并且在体外实验中证明了Lon蛋白对Hfq的降解作用，研究人员认为Lon蛋白可通过Hfq间接参与调控sRNA的表达[18]。 Lon蛋白酶的作用底物具有多样性，目前只鉴定出少数底物蛋白且进展缓慢。定量蛋白质组学作为一种新兴成熟的实验技术，在筛选Lon蛋白酶底物研究中具有天然的优势。Arends等利用Laber-free定量蛋白质组学方法在E. coli中新筛选出14个Lon蛋白作用底物，这些底物蛋白主要参与细菌氧化应激、核酸合成、氨基酸和能量代谢生理过程[28]。利用定量蛋白质组学技术筛选Lon蛋白酶的潜在底物可极大推进人们对Lon蛋白酶作用功能的认识。 5 Lon蛋白上游调控网络研究

在先前研究报道中，lon基因属于热应激操纵子(Heat-shock regulon，HS)，热应激可诱导lon基因的表达[29-30]。Robertson等通过Northern实验发现流产布鲁氏菌(Brucella abortus)在热休克以及其他压力环境下，lon基因的转录水平上调，但具体的调控方式仍需进一步研究[31]。然而也有例外，Myxococcus xanthus[32]中的lon同源基因并不是热诱导的，在不同的细菌中，lon基因的转录调控方式也不尽相同。 E. coli通过σ32因子激活HS的转录活性，在正常条件下DnaK分子伴侣系统和HflB蛋白酶使σ32因子处于非稳定状态，而在热应激环境下，细胞内积聚的非折叠蛋白竞争性与DnaK和蛋白酶结合，导致形成稳定状态的σ32因子，进而直接促进lon基因的表达[33]。B. subtilis在高渗、乙醇、H2O2和嘌呤霉素的环境胁迫下可诱导lonA基因的表达[29]，但是这种转录激活作用并不依赖于压力应激σB因子，其内在的调控机制尚不明确。变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)除了通过HspR (Heat-shock protein regulator)负向调控lon基因表达外，还通过ClgR正向诱导Lon蛋白合成，发挥Lon蛋白酶活性降解错误折叠蛋白。同时ClgR还能被ClpP降解，形成负反馈调节机制，避免Lon蛋白过度表达[30]，但是何种环境条件触发ClgR的表达仍不清楚。正常环境下细菌胞内蛋白酶的量必须维持在恰当的水平，以维持细菌正常的生理过程，然而在特定情况下，细菌胞内Lon的蛋白水解作用有利于细菌在逆境中存活，然而人们对Lon蛋白表达调控的机制知之甚少[3]。 6 结论与展望

细菌胞内Lon及其他ATP依赖蛋白酶介导的蛋白降解机制是一种保守机制，它可降解细菌胞内错误折叠蛋白，对于维持细菌胞内的蛋白质平衡具有重要意义。同时，Lon蛋白由于作用靶点具有多样性而在细菌胞内发挥多重作用。研究表明，lon基因缺失可影响细菌生长速度[26]、胁迫环境下的耐受能力[16]、抗生素敏感性[6]以及毒力[17]。在先前研究报道中，B. abortus在热应激、酸性条件(pH 4.5)、EtOH、嘌呤霉素等应激环境下可引起lon基因的转录上调，lon基因缺失株在体外应激环境中表现出抵抗力下降，并影响B. abortus对小鼠模型的早期感染[31]。由于其中的分子机制尚不明确，因此本实验室采用原核细胞转录测序技术揭示了lon基因缺失与细菌对应激环境敏感性上升和毒力下降之间的分子机制[34]。研究发现lon基因的缺失可引起布鲁氏菌胞内大量与热应激、压力应激相关基因以及转录调控因子的转录发生变化，提示正常表达的Lon蛋白参与细菌胞内一系列重要生理过程，但是Lon蛋白调控这些生理过程的机制和方式有待后续进一步研究。由于我们对Lon蛋白在B. abortus细菌内的作用靶点及其调控网络了解得不够清楚，接下来我们将利用蛋白质组学开展Lon蛋白下游靶点研究，并设计体外酶降解实验对Lon蛋白酶的底物进行鉴定。另外，在应用研究方面，我们将以lon基因为修饰靶点构建基因工程弱毒疫苗，利用动物模型评价基因工程弱毒疫苗的安全性和有效性，最终实现控制布鲁氏菌病流行传播的目的。

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